IL-7、IL-15液体细胞因子如何保持稳定？Akron CSS制剂筛选与12个月研究数据解析

摘要： 在CAR-T及其他细胞治疗制造研究中，IL-7、IL-15等细胞因子不仅参与T细胞生长和扩增，其原料状态、配制方式及稳定性也会影响实际生产操作。传统冻干细胞因子需要复溶和分装，而低浓度液体制剂则面临蛋白聚集、氧化、容器表面吸附及长期活性维持等问题。Akron Bio公开的Closed System Solutions（CSS）制剂开发资料，比较了三种缓冲液、表面活性剂及抗氧化辅料组合，分析0.01 mg/mL重组人IL-15和IL-7在一次性袋中的理化稳定性及生物学活性，并进一步比较液体CSS与冻干剂型在健康供者T细胞培养中的表现。本文围绕制剂筛选、RP-HPLC、SDS-PAGE、2–8℃长期储存和细胞功能评价等技术问题，整理IL-15的12个月、IL-7的9个月稳定性数据。

关键词：IL-7、IL-15、液体细胞因子、Akron Bio、Closed System Solutions、CSS、细胞因子稳定性、RP-HPLC、SDS-PAGE、CAR-T、T细胞培养、冻干细胞因子、cGMP细胞因子

一、为什么细胞治疗制造开始关注即用型液体细胞因子

细胞因子是工程化免疫细胞培养过程中的重要组成部分。在T细胞激活和扩增研究中，T细胞受体TCR信号与共刺激信号之外，还需要考虑细胞因子提供的进一步生长和存活支持。IL-2、IL-7和IL-15均属于共用γ链（Common Gamma Chain，γc）细胞因子家族，能够参与调节T细胞的生长、扩增及不同培养状态。因此，在CAR-T及相关细胞制造研究中，除了关注细胞因子本身的生物学作用，也需要关注这些原料以何种剂型进入制造流程。

在传统研究中，重组细胞因子通常以冻干形式保存，使用时先按照要求进行复溶，再将所需工作液加入培养体系。对于开放式实验室培养，这种方式具有较多应用经验；但随着细胞治疗生产逐步向封闭化、自动化和不同生产单元协同发展，试剂配制、转移及加入培养系统等操作也越来越需要纳入完整工艺设计。

特别是自体细胞治疗制造中的单批次细胞因子用量可能较小，如果每批都需要复溶较大规格冻干品并再次分装，便会增加物料处理、操作时间和批次记录相关工作。因此，低剂量、单次使用、即用型液体细胞因子成为值得研究的剂型方向之一。

不过，液体剂型并不是简单地将冻干蛋白溶于缓冲液后装入一次性袋。蛋白质在液体形态下需要面对化学和物理稳定性问题，尤其当浓度降低时，容器表面吸附、聚集及氧化等因素可能对最终可检测的蛋白质数量和活性产生影响。

二、Akron CSS封闭系统的制剂研究重点是什么

Akron Bio长期从事细胞与基因治疗相关辅助原料的研发和制造，相关材料包括重组细胞因子、生长因子及人源培养补充物。其Closed System Solutions（CSS）系列围绕封闭生产流程中的液体原料交付形式开展开发，相关产品类别包括人AB血清、人血清白蛋白HSA及重组人细胞因子。

本次公开制剂开发资料重点分析重组人IL-7和重组人IL-15在低浓度液体状态下的稳定性。研究将相关蛋白配制至0.01 mg/mL，并利用小规格一次性袋开展制剂筛选及长期储存评价，尝试解决低浓度蛋白质在储存过程中可能发生的氧化、聚集以及容器吸附问题。

研究不仅比较不同缓冲液组合，还通过RP-HPLC、还原型SDS-PAGE和细胞生物学活性测定，分析同一制剂在储存过程中的不同质量属性。这种多指标分析尤其重要，因为蛋白质浓度、纯度与生物学效价并不完全相同，任何单一检测方法都不足以替代其他质量指标。

相关细胞治疗辅助材料与封闭系统技术资料也涉及此类液体原料在封闭制造工作流程中的应用背景。

三、IL-7和IL-15液体制剂采用哪些分析方法

研究所使用的制剂原料和相关辅料按照公开资料中的cGMP相关要求进行制备。重组人IL-7和IL-15的生产及纯化采用Akron已有冻干产品所使用的、经过验证的相关工艺，以减少更换剂型时由上游蛋白制备差异引入的额外变量。液体CSS研究样品采用Entegris Aramus 2D一次性袋组件灌装，以评价蛋白质在实际目标包装系统中的表现。

理化分析方面，研究使用反相高效液相色谱RP-HPLC测定蛋白质浓度和纯度，并使用还原型SDS-PAGE观察蛋白质相关条带和纯度变化。RP-HPLC浓度计算采用未氧化rHuIL-7或rHuIL-15对应色谱峰的积分，因此这一浓度指标不仅反映蛋白回收，还与研究所采用的未氧化峰定义有关。

生物学活性方面，研究使用2E8细胞测定rHuIL-7相关活性，使用CTLL-2细胞测定rHuIL-15相关活性。数据分析采用平行线浓度-反应模型，并参照NIBSC相关标准估算相对效价，遵循USP<1032>《生物测定的设计与开发》及USP<1034>《生物测定的分析》所列原则。

这种设计使研究不仅能回答蛋白在储存以后是否仍可通过色谱检出，还能进一步观察其在细胞功能测定中是否保留相应生物学作用。对低浓度液体细胞因子而言，理化稳定性和生物学效价属于需要联合评价的两个维度。

四、三种IL-15制剂为什么要同时比较缓冲液、去污剂和抗氧化辅料

低浓度液体细胞因子可能面临多种降解或损失途径，因此单独调整一个缓冲液参数不一定能够解决全部问题。研究围绕IL-15设计了三种制剂，分别比较中性和酸性缓冲体系、两类具有不同理化性质的去污剂，以及是否加入抗氧化辅料，以观察不同组合对低浓度蛋白质初始稳定性的影响。

三种制剂所用rHuIL-15原料量在原稿表格中均列为0.01 mg，正文则描述为用于0.01 mg/mL浓度体系的初始稳定性评价。表中原始数据如下：

制剂I采用中性缓冲体系和去污剂1，不含抗氧化辅料；制剂II采用酸性缓冲体系、去污剂2和抗氧化辅料；制剂III则采用中性缓冲体系、去污剂2和抗氧化辅料。去污剂的设计思路主要涉及减少蛋白聚集、降低包装材料吸附及改善物理稳定性，而抗氧化辅料则用于评价其对化学氧化途径的潜在保护作用。

需要注意，这种筛选属于多组分组合比较，因此不同制剂之间出现稳定性差异，并不能直接证明某一个单独辅料就是全部差异的唯一原因。尤其制剂I与制剂II、III同时存在缓冲液、去污剂和抗氧化辅料差异，应将结论限定在完整配方组合的比较上。

五、一个月初筛结果：为什么制剂I没有进入后续优选方案

研究在配制后即刻及一个月两个时间点，对三种IL-15制剂进行RP-HPLC检测，重点观察一次性CSS袋中未氧化IL-15的可检测浓度和纯度变化。为了帮助判断色谱峰的来源，还同步提供了不含IL-15的稀释液、IL-15标准品、未配制的原液及完整CSS制剂对应的色谱图。

结果显示，制剂I在一个月内已经出现明显的指标下降。IL-15浓度由约6.0 μg/mL降至约3.8 μg/mL，纯度由约87%降至约73%，色谱图中还出现额外峰，提示该组合未能较好维持研究所关注的蛋白质理化状态。

相比之下，制剂II在一个月时的浓度约为9.0 μg/mL，纯度约83%；制剂III的浓度约8.0 μg/mL，纯度约85%。虽然这两个组合并不代表所有指标完全相同，但都比制剂I显示出更适合继续研究的初期表现，因此进入后续长期稳定性比较。

这一结果体现了低浓度液体蛋白制剂开发中的一个关键问题：即使初始均采用相同标称蛋白浓度，不同辅料组合仍可能导致储存后的未氧化蛋白浓度和色谱纯度出现明显差别。因此，判断一种制剂是否适合长期储存，需要观察配制后的实际稳定性，而不能只依靠理论浓度或初始配方组成。

六、IL-15制剂II的12个月数据说明了什么

完成初筛以后，研究将IL-15使用制剂II配制为0.01 mg/mL，按每袋5 mL灌装于20 mL CSS袋，在2–8℃条件下开展12个月稳定性研究。研究分别通过电位法测定pH、RP-HPLC测定浓度及纯度，并在不同时间点开展还原型SDS-PAGE分析。

结果显示，制剂II在12个月观察期内pH大致维持在6.3至6.5之间。SDS-PAGE纯度总体保持在90%以上，多数时间点约95%至97%，12个月约96%，其中第9个月未进行该项检测。与此同时，RP-HPLC纯度由初期约85%逐渐降至12个月时约65%，浓度在6.7至8.6 μg/mL之间波动，12个月约6.8 μg/mL。

这组数据特别值得注意的是，SDS-PAGE纯度和RP-HPLC纯度在储存过程中并未呈现完全相同的变化趋势。SDS-PAGE在12个月时仍显示较高的相应条带纯度，但RP-HPLC纯度已经明显下降。因此，“SDS-PAGE纯度保持较好”不能直接写成“所有理化纯度指标均保持稳定”。

从该公开研究的整体比较看，制剂II在12个月内保持了相对平稳的pH，并在后续生物学效价研究中显示出持续活性，因此具有进一步开发价值。但正式货架期和放行合格性仍然需要结合预先设定的质量标准判断，不能仅凭存在12个月观察结果就直接认定所有批次都已满足商业货架期要求。

七、为什么IL-15制剂III在12个月时表现不如制剂II

研究采用相同的0.01 mg/mL IL-15浓度、每袋5 mL的装量及20 mL CSS袋，对中性缓冲体系的制剂III开展12个月储存评价，分析方法与制剂II一致。

制剂III的pH在储存期间维持约7.3至7.5，相对稳定，但其他理化指标在后期出现明显变化。SDS-PAGE纯度在前6个月约96%至98%，12个月降至约76%；RP-HPLC纯度从约89%下降至约39%；未氧化IL-15浓度由约8.3 μg/mL持续下降至约3.6 μg/mL。

与制剂II相比，制剂III虽然能够维持较稳定的pH，但蛋白质浓度和纯度在长期储存中下降更明显。这个结果说明，单独保持pH数值稳定并不等于蛋白质的整体理化状态已经得到充分保护，仍然需要结合蛋白自身的化学降解、吸附和聚集相关指标综合评价。

在所测试的完整配方组合中，含酸性缓冲体系的制剂II对IL-15表现出相对更好的长期稳定性。但由于制剂设计还包含其他辅料因素，这一结果并不能直接推广为所有IL-15蛋白在任何酸性条件下都优于中性条件。

八、IL-7制剂II为什么在9个月内保持较高的色谱纯度

研究进一步将重组人IL-7使用制剂II配制为0.01 mg/mL，每袋10 mL，灌装于20 mL CSS袋，并在2–8℃条件下开展9个月理化稳定性研究。同样使用pH测定、还原型SDS-PAGE和RP-HPLC进行评价。

结果显示，IL-7制剂II的pH保持在约6.1，SDS-PAGE纯度约95%至96%，RP-HPLC纯度约98%至99%，9个月时检测到的蛋白质浓度约为7.4 μg/mL。

从纯度角度看，制剂II在所观察的9个月内显示出较平稳的结果。但与此同时，9个月时的实际检测浓度约为7.4 μg/mL，低于0.01 mg/mL对应的10 μg/mL标称浓度。因此，不能只根据纯度百分比判断蛋白质是否完全没有损失，还需要分别考察浓度变化和实际可用蛋白量。

九、IL-7制剂III为什么出现更明显的浓度下降

IL-7制剂III采用相同的0.01 mg/mL标称浓度、每袋10 mL及20 mL CSS袋包装，在2–8℃储存9个月，理化评价方法与制剂II一致。

结果显示，制剂III的pH维持约7.2，SDS-PAGE纯度约93%至94%，RP-HPLC纯度约96%至98%，说明在所采用的分析方法中仍可观察到较高的纯度指标。但9个月时浓度下降至约3.8 μg/mL，明显低于制剂II的约7.4 μg/mL。

这组数据说明，即使两个制剂在某些纯度指标上都表现较好，其未氧化蛋白质浓度仍可能存在明显差异。对于低浓度液体细胞因子，实际回收浓度是不可忽略的质量属性。如果单纯以蛋白纯度百分比评价制剂，很可能遗漏蛋白质吸附或其他导致可检测浓度下降的影响。

因此，在所比较的IL-7完整配方中，制剂II不仅保持相对较好的纯度，也表现出更高的9个月检测浓度，更值得作为后续制剂评价的基础。

十、理化纯度下降以后，为什么还要测量生物学活性

IL-7和IL-15都是需要通过特定细胞作用发挥功能的蛋白质，因此制剂开发不能只停留在化学或物理检测。研究进一步使用2E8细胞和CTLL-2细胞评价相应活性，并将测得的效价与标准进行比较，以分析储存时间对生物学功能的影响。

在IL-7研究中，制剂II和制剂III均以0.01 mg/mL配制，每袋10 mL，在2–8℃储存9个月。结果显示，两种制剂在第9个月时，每袋测得的生物学活性均保持在10 MIU以上。

对于IL-15，两种制剂均以0.01 mg/mL配制，每袋5 mL，在2–8℃储存12个月。制剂II在整个12个月研究中每袋活性保持在约0.45至0.5 MIU范围；制剂III则在第9个月降至约0.3 MIU，12个月时回到约0.4 MIU。整体比较中，制剂II的活性曲线相对平稳。

这些结果说明，理化纯度、未氧化蛋白浓度和生物学效价并不一定具有完全一致的变化趋势。某一制剂的HPLC纯度下降，并不自动代表相应生物学活性已经按相同比例降低；反过来，细胞效价仍然可检测，也不意味着理化降解可以忽略。

因此，更完整的液体细胞因子稳定性评价需要将色谱、凝胶电泳、蛋白浓度、pH及细胞活性检测共同纳入研究，而不是依赖单一指标。

十一、液体CSS与冻干IL-7/IL-15在T细胞培养中有什么区别

在完成理化和生物学活性测定以后，研究团队进一步使用健康供者来源T细胞评价液体CSS细胞因子能否在实际培养体系中发挥与冻干剂型相近的作用。

实验采用两名健康供者的冷冻单采血材料，经过复苏、分选与活化后，在培养基中分别添加复溶后的IL-7和IL-15冻干细胞因子，或者相应CSS液体制剂。IL-7最终浓度为600 IU/mL，IL-15为100 IU/mL，同时加入IL-2至100 IU/mL。配制完成的培养基在2–8℃条件下保存，并在加入细胞因子后的第12天使用。

细胞收获时，研究分析CAR阳性细胞比例和CD4+/CD8+细胞亚群比例，并在收获细胞经过冻存和数日后复苏以后检测其活率，以模拟后续细胞材料储存相关过程。

结果显示，冻干组CAR阳性比例约47%，液体CSS组约45%，两组结果接近；同一供者使用两类剂型培养时，CD4+/CD8+亚群比例保持相似；冻存复苏以后，CD4+细胞活率约97%至98%，CD8+细胞活率约84%至88%，液体组与冻干组也较为接近。

这一实验说明，在所采用的两名健康供者和特定细胞培养条件下，液体CSS与冻干剂型能够获得相近的所测T细胞相关结果。但样本量较小，所检测的终点也有特定范围，因此不能将该研究直接解释为两类剂型已经在所有细胞治疗工艺中证明完全等效。

十二、液体细胞因子制剂的关键质量属性应该怎样理解

从整组研究来看，液体IL-7和IL-15制剂的质量评价不应只围绕“是否可以在冰箱中储存”这一问题展开。更重要的是确认低浓度蛋白质在具体缓冲液、辅料和容器组合中，能够保留多少可检测蛋白、呈现怎样的降解谱、是否维持必要生物学活性，以及最终加入T细胞培养以后能否支持目标功能。

例如，IL-15制剂II与制剂III在pH变化方面都相对平稳，但12个月时的HPLC纯度分别约为65%和39%，浓度约为6.8 μg/mL和3.6 μg/mL。这说明pH稳定不足以代表蛋白质整体稳定。

又如，IL-7两种制剂在9个月时仍具有较高的HPLC纯度和可测生物学效价，但检测浓度分别约为7.4 μg/mL和3.8 μg/mL。因此，纯度、浓度与生物学效价应作为不同指标评价，而不能相互替代。

对于实际封闭系统生产研究，还需要进一步考虑包装材料、灌装体积、运输与储存条件、物料连接方式及既定质量标准。稳定性研究为相关剂型选择提供数据基础，但并不自动替代正式工艺验证或货架期确认。

十三、液体CSS在细胞治疗工艺中的实际研究意义

细胞治疗制造过程中，辅助原料的剂型可能影响工艺设计和单元操作数量。冻干细胞因子需要复溶与必要的转移步骤，而预先配制的液体细胞因子可以为封闭式使用和单次剂量交付提供另一种形式。

但这种流程层面的潜在便利，必须建立在制剂稳定性和功能已经得到充分评价的前提上。如果液体制剂在储存过程中出现明显蛋白质损失或者活性变化，那么减少操作步骤并不足以说明整体工艺更加适合生产。

Akron Bio公开研究中的IL-15制剂II和IL-7制剂II显示，利用适当的缓冲液和辅料组合，可以在低浓度液体条件下获得一定时间范围内可测的理化及生物学活性结果。而与冻干剂型的初步T细胞比较，也为进一步评价其在细胞培养流程中的适用性提供了实验基础。

十四、总结

IL-7和IL-15液体细胞因子的制剂开发，本质上是如何在低浓度、液体形态和一次性袋包装条件下，同时控制蛋白质理化变化和保持相应生物学活性的问题。

Akron Bio公开研究比较三种IL-15制剂以后发现，包含酸性缓冲体系、去污剂2及抗氧化辅料的制剂II，在所比较的完整配方中表现较好。长期研究中，IL-15制剂II在2–8℃储存12个月后仍具有可测生物学活性，但其RP-HPLC纯度也出现下降；IL-7制剂II在9个月内保持较高纯度及可测活性，检测浓度则需要作为独立质量指标持续关注。

此外，两名健康供者T细胞的剂型比较显示，液体CSS和复溶冻干细胞因子在相应CAR阳性比例、CD4+/CD8+亚群组成及冻存复苏后活率方面具有接近的观察结果。

因此，液体细胞因子剂型的价值不能仅用“即用型”描述，而应建立在配方筛选、长期理化检测、生物学效价、实际细胞培养表现及后续工艺适配验证等多项证据之上。

参考文献

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[2] Gitlin G, et al. Pharmaceutical Research. 1996;13:762-769.

[3] Torosantucci R, et al. Molecular Pharmaceutics. 2013;10:2311-2322.

关于技术来源

本文基于Akron Bio公开的IL-7、IL-15 CSS液体制剂开发资料及相关蛋白质稳定性研究文献，曼博生物MineBio整理，用于科研信息分享、细胞治疗辅助原料研究和液体蛋白制剂评价参考。文中关于制剂组成、0.01 mg/mL浓度、2–8℃储存、RP-HPLC、SDS-PAGE、生物学效价和T细胞培养的结果均对应具体研究条件，不应直接视为所有批次或全部细胞治疗制造流程的固定性能表现。正式货架期、放行和工艺适用性仍需结合实际质量标准及验证数据确认。
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