MSC从2D培养转向3D生物反应器，如何保证细胞质量一致？PDL、CQA与50L放大解析

摘要： 间充质基质细胞（MSC）从二维贴壁培养转向三维微载体生物反应器时，制造规模和细胞产量可能明显改变，但真正需要验证的是不同工艺获得的细胞是否具有可比较的关键质量属性（CQA）。影响MSC一致性的因素不仅包括培养模式，还涉及供体差异、累计群体倍增水平（PDL）、群体倍增时间（PDT）、培养基、剪切和氧传递等变量。RoosterBio相关公开研究以PDL作为工艺比较的重要参考，分析2D与3D培养细胞的身份标志、三系分化、IDO免疫调节功能和细胞因子分泌谱，并开展0.1 L微载体培养、多供体验证以及0.25 L、15 L和50 L规模相关研究。本文结合公开论文与技术案例，系统讨论MSC规模化中的产品漂移、PDL控制、批间一致性及MSC-EV生产工艺的可比性问题。

关键词：MSC规模化培养、间充质干细胞、MSC生物反应器、2D和3D可比性、PDL、PDT、产品漂移、批间一致性、关键质量属性、CQA、IDO、RoosterBio、MSC-EV、细胞治疗工艺放大

一、为什么MSC规模化培养不能只看最终产量

间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells，MSC）从早期研发走向大规模制造时，生产目标通常会从获得数百万或数千万个细胞，逐渐转向能够稳定形成更大批量的细胞产品。在小规模研究中，二维培养瓶或多层细胞工厂能够满足部分实验需求，但当制造规模持续增加时，操作面积、人工需求、培养基消耗和批次一致性都会成为需要解决的问题，因此采用微载体和生物反应器进行三维培养成为重要的技术方向。

不过，扩大培养规模并不等于简单增加细胞数量。细胞治疗产品的一个特殊之处，是最终产品本身就是经过制造过程培养、扩增和处理的活细胞。如果从2D细胞工厂切换到3D生物反应器以后，细胞身份、分化状态、免疫调节功能或分泌行为发生变化，即使最终获得更多细胞，也不能直接认为新工艺与原工艺具有完全相同的产品属性。

这种因制造条件变化而导致细胞质量属性出现改变的现象，常被概括为产品漂移（Product Drift）。从细胞治疗开发角度看，产品漂移可能发生在培养模式切换、供体变化、培养基和原材料变化，以及反应器放大等不同阶段。

因此，MSC规模化工艺最重要的问题并不是“50 L反应器能培养出多少细胞”，而是“从2D进入3D、从小型设备进入大规模系统以后，能否通过具体数据证明细胞仍然符合预期的身份、质量和功能要求”。

二、MSC产品漂移主要来自哪些环节

2026年Cell & Gene Live关于MSC规模化风险的行业讨论中，来自Mesoblast、MEDIPOST和Kiji Therapeutics的产业研究人员围绕制造工艺变化、细胞效力及产品一致性展开交流。其中一项重要认识是，规模化不仅需要解决工程产能，还必须考虑不同制造阶段得到的细胞是否能够维持与预期功能有关的质量属性。

这一讨论与MSC生物工艺开发具有直接联系。细胞培养模式、供体来源和反应器规模都可能发生变化，而且不同变量往往互相影响。原稿将MSC制造中的漂移风险划分为工艺漂移、供体变异和规模漂移三类。

工艺漂移主要涉及制造操作和培养环境的改变。例如从普通贴壁培养转向微载体悬浮培养以后，细胞接触的基质、培养液运动方式和收获过程都会变化；即使细胞来源完全相同，最终质量属性仍有可能受到影响。

供体变异则来自不同起始细胞之间的生物学差异。不同供体MSC的增殖速度、细胞状态和最终产量可能不同，因此一套在某一供体中表现较好的工艺，并不能自动证明适用于所有供体。

规模漂移主要涉及不同反应器之间的流体环境差异。随着工作体积增加，混合、传氧、剪切、营养梯度和取样代表性等参数可能发生变化。即使在相同培养基配方下，不同设备仍可能形成不同的细胞生长环境。

三、PDL是什么，为什么它能够作为MSC工艺比较的重要参考

PDL是Population Doubling Level的缩写，中文通常称为群体倍增水平，用于描述细胞群体在培养过程中累计经历的倍增程度。与简单的传代次数或者最终细胞数量相比，PDL能够提供一个更接近细胞累计扩增历史的定量指标。

例如，两个培养体系可能最终获得不同的细胞密度，但如果起始细胞量、扩增过程和累计倍增得到合理记录，就可以进一步判断两组细胞是否在相近的累计扩增水平下进行比较。对于MSC而言，这一点具有重要意义，因为累计扩增历史可能与细胞增殖状态和部分功能特征有关。

RoosterBio相关研究提出，在比较2D和3D培养细胞的质量属性时，应当关注两组细胞是否达到相近的最终PDL。其技术逻辑是尽量减少细胞累计扩增程度差异带来的干扰，使两种制造方式之间的比较更加合理。

但这里需要区分两个概念：相同PDL是提高实验可比性的一种设计方法，并不等于CQA自动相同。 即使两组细胞达到相近PDL，仍需要通过表面标志物、三系分化、免疫调节和分泌谱等具体实验验证其质量属性。

四、PDL与PDT为什么不能混为一谈

除了PDL，MSC培养还经常使用PDT（Population Doubling Time，群体倍增时间）描述细胞生长速度。PDL主要反映累计倍增程度，PDT则反映完成一次群体倍增所需要的时间。两个指标相互联系，但并不是同一个概念。

在RoosterBio相关2D和3D工艺资料中，研究团队关注两种培养方式是否能够获得相近的累计PDL和相似的倍增时间。例如原稿整理的参数中，2D与3D的PDT均约为24小时，并将最终PDL作为共同的工艺终点。

不过，PDT并不只由培养基配方决定，还可能受到细胞来源、培养密度、表面基质、环境控制和生物反应器条件影响。因此，原稿中关于“PDT不随培养模式改变”的描述，更适合理解为特定研究条件下希望达到或者观察到的工艺表现，而不是普遍适用于所有MSC培养方式的生物学规律。

需要特别注意，原稿表格中的“一代”指的是细胞经过一次传代操作时的代次记录，与通过细胞数量变化计算的PDL并不等同。实际工艺中，同样进行一次传代，细胞可能经历不同的倍增数量，因此不能直接用传代次数替代累计PDL。

此外，2D接种密度常用cells/cm²表示，而3D微载体培养还可以使用cells/mL以及单位微载体面积对应的细胞数量表示。比较不同培养方式时必须明确分母与基质面积，不能将两个单位不同的数值直接作为高低比较。

五、RoosterBio关于2D和3D可比性提供了哪些研究证据

RoosterBio公开资料整理了多项与MSC二维和三维培养相关的研究，涉及脐带来源MSC、骨髓来源MSC以及不同生物反应器工艺。这些研究共同关注的并不是某一种培养方式能够获得更高细胞密度，而是不同培养模式下的细胞是否具有可比较的质量属性。

2020年Adlerz等人发表于《Cytotherapy》会议增刊的研究摘要，讨论了无异种动物源成分条件下，采用生物反应器扩增脐带来源MSC的可行性及其与二维培养的比较。相关研究关注2D培养向3D生产模式转换以后，细胞状态与关键质量属性能否得到维持。由于这一来源属于会议摘要，引用其结论时应与完整同行评审研究进行区分。

2019年ISCT相关研究海报和RoosterBio技术资料还比较了二维培养瓶与三维生物反应器所获得MSC的生长、PDL、表面标志物、多系分化、细胞因子分泌和可诱导免疫调节等指标，为分析不同工艺模式下的细胞属性提供了多个观察维度。

2020年Lembong等人发表于《Bioengineering》的完整研究，则围绕无异种动物源成分条件下的微载体三维扩增展开，分析生物反应器工艺参数、补料分批培养、多个MSC供体及收获后细胞特征，并报告了具体的培养密度和PDL数据。

这些资料从不同角度支持了一个共同的方法学思路：进行MSC工艺可比性研究时，应当将细胞累计扩增程度和具体功能指标放在同一个分析框架中，而不是只比较最终细胞数量。

六、0.1 L微载体培养研究有哪些可参考的数据

Lembong等人在2020年的研究中，使用多名供体来源的人MSC，在无异种动物源成分条件下建立微载体补料分批培养体系。研究以垂直轮生物反应器为平台，重点优化细胞接种、悬浮培养及后续收获等环节，并观察培养过程中的细胞数量、代谢变化和质量属性。

研究报告，在所优化的工艺中，MSC可在5天培养周期内达到约2×10⁵–6×10⁵ cells/mL，最终PDL维持在16–20范围。研究还表明，不同供体之间可能存在细胞扩增差异，但优化后的工艺能够在所测试供体中保持相关细胞表型及功能特征。

这里的PDL 16–20属于相应研究所用MSC细胞库和扩增工艺的最终累计水平，并不是所有MSC产品的统一目标。其具体意义还与起始细胞库的PDL和后续扩增历史有关，因此不能脱离起始条件把16–20直接当作任何MSC生产过程的固定终点。

该研究还强调补料分批培养的意义。由于培养过程中部分营养物质和促增殖相关成分会逐渐消耗，适当的补料策略可以帮助维持细胞扩增，而不一定需要采用完整换液方式。相关结果体现出培养基、补料、细胞密度和生长状态之间的联系。

七、为什么同一套工艺下不同供体的最终密度仍可能不同

MSC属于生物来源细胞，供体之间的天然差异不会仅因为采用同一种培养基和反应器而完全消失。因此，评价一套MSC培养工艺是否具有稳健性时，不应要求所有供体最终获得完全相同的细胞数量，而应观察不同供体是否能够在可接受范围内重复培养过程，并维持目标质量属性。

原稿整理的RoosterBio资料显示，在相关微载体和垂直轮研究中，不同供体的最终细胞密度可以出现明显变化，公开案例涉及0.2–0.7×10⁶ cells/mL的范围，也有5天培养达到2–6×10⁵ cells/mL的研究结果。

这些数据表明，不同供体可能具有不同的增殖能力和最终产量，因此应将细胞产量差异与细胞质量差异分别分析。某一供体产量较低，并不能直接证明其表面标志物、分化潜能和其他功能指标必然不合格；反过来，达到较高细胞密度，也不能自动证明其功能质量与其他供体完全相同。

多供体可比性评价更合理的目标，是在明确供体差异的基础上，观察工艺是否能够维持可接受的细胞身份、功能和生产一致性，并建立适合实际产品的质量控制范围。

八、从0.25 L到15 L和50 L，规模放大数据说明了什么

除了0.1 L垂直轮微载体培养研究，RoosterBio与Sartorius相关公开技术资料还介绍了另一组采用Ambr250和Biostat STR等设备开展的工艺开发与放大研究。

在该体系中，Ambr250作为约0.25 L的小规模研究平台，可用于培养参数优化及规模相关比较；Biostat STR用于15 L和50 L等更大培养规模。相关资料报告，在50 L生产体积下进行了两次独立运行，每批均获得超过2.5×10¹⁰个MSC，即超过250亿个细胞。

RoosterBio公开案例还指出，相关50 L培养过程与Ambr250缩小模型在培养周期和最终细胞密度等方面具有相近表现，显示该工艺能够在所测试的设备和细胞条件下获得具有参考价值的规模相关一致性。

这里需要特别区分两组工艺证据：0.1 L垂直轮研究与0.25 L Ambr250、15 L和50 L搅拌罐研究涉及不同设备构型，不应简单合并成一条已经对全部工艺变量完成验证的连续放大路线。对于每一次设备转换，仍然需要独立分析剪切、传质、DO、pH、细胞密度及关键质量属性。

因此，50 L两批超过250亿个细胞的结果说明相关研究体系具有实际放大能力，但不代表所有MSC来源、培养基和反应器都能自动实现相同产量。

九、MSC可比性为什么要同时分析身份、分化、IDO和细胞因子

如果两组MSC在2D和3D培养以后具有相近PDL，下一步仍然需要回答这些细胞在质量属性方面是否可比。RoosterBio相关研究涉及表面标志物、分化能力、可诱导免疫调节功能和细胞因子分泌谱等不同维度，原因是这些指标分别反映MSC的不同生物学特征。

在细胞身份方面，研究检测CD90、CD166等阳性标志物以及CD34、CD45等阴性标志物，用于判断目标细胞群体是否保持相关MSC表型。三系分化评价则观察细胞向骨、脂肪和软骨相关方向的分化能力，从另一角度判断培养过程中是否保留部分典型生物学特征。

免疫调节方面，研究可通过IFN-γ相关刺激后测定IDO活性等指标，观察细胞在特定刺激条件下的功能反应。分泌谱分析则关注VEGF、IL-8、bFGF、HGF、TIMP1和TIMP2等相关因子，辅助评价培养条件改变是否影响细胞的分泌特征。

对于具体治疗产品，还可能需要结合适应证和作用机制增加相应功能性或体内研究终点。因此，MSC可比性不能只靠一个通用表面标志物或者三系分化结果决定，而应根据产品自身的关键质量属性建立适合的评价组合。

十、为什么体内效力和分析可比性需要区分

2026年Cell & Gene Live的行业讨论特别强调，制造变更以后的分析可比性与最终临床可比性并不是完全相同的问题。即使两个制造工艺获得的细胞具有相近的表面标志物、分化能力和体外功能指标，仍然需要进一步判断这些指标是否足以代表具体产品的作用机制及临床相关功能。

原稿整理的建议比较框架如下：

上表属于根据公开资料整理的评价框架，并不代表每一项原始研究都完整实施了全部五个维度。具体到细胞治疗项目，哪些检测应作为关键质量属性、效力相关指标或补充表征，需要结合产品的预期作用机制和研究阶段确定。

十一、培养基与起始细胞材料为什么也影响可比性

MSC可比性研究不仅涉及生物反应器，还涉及培养基、起始细胞库以及其他制造原料。即使研究人员采用相同反应器，如果更换了培养基成分或起始供体细胞，最终产品仍可能发生变化。因此，建立跨研发和制造阶段的技术路径时，需要明确哪些原料和工艺条件能够保持连续性。

RoosterBio的相关产品体系覆盖无异种动物源成分MSC培养基、cGMP相关培养材料及MSC-EV生产研究工具，目的是为从早期研究到更大规模工艺开发提供不同级别和用途的原料选择。

不同等级的研究材料和生产材料可能具有不同的质量文件、放行控制和适用要求。因此，RUO与cGMP材料之间即使具有相近配方和相关技术路径，也不能默认不经验证便完全互换。

关于相关原料和培养体系，可结合MSC扩增与细胞外囊泡工艺技术资料了解其公开应用背景。实际工艺仍需根据具体细胞来源、原料等级与目标质量属性进行独立评价。

十二、MSC-EV生产为什么需要关注母细胞工艺一致性

除了将MSC本身作为研究对象，部分细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）研究也以MSC为生产来源。这使上游母细胞扩增与后续EV收集之间形成联系，因此MSC培养工艺的变化可能进一步影响EV生产过程。

例如，不同供体MSC在生长速度和最终细胞密度方面存在差异，培养方式从2D转向3D后，细胞接触的基质、流体环境和代谢状态也会改变。这些变量可能影响细胞分泌活动和EV相关产出，因此需要结合具体实验研究。

RoosterBio相关MSC-EV工艺资料包括用于MSC扩增的培养基、EV收集相关配方以及下游纯化材料，但这类完整工艺体系并不意味着所有MSC-EV样品天然具有相同的组成或功能。对于EV研究，还需要在母细胞身份与扩增过程以外，进一步分析EV产量、颗粒特征、杂质背景和与目标应用相关的功能指标。

因此，MSC细胞可比性为EV工艺建立提供重要背景，但不能直接替代最终EV产品自身的质量分析。

十三、FDA Type II Master File对MSC工艺意味着什么

RoosterBio公开资料介绍，部分cGMP相关细胞与培养材料受到美国FDA Type II Master File支持。这类文件主要为相关制造或原料质量信息的提交与授权引用提供机制，能够帮助产品开发团队在适用情形下使用对应质量资料。

但需要明确，Master File的存在并不等于FDA已经批准该材料用于所有细胞治疗产品，更不意味着使用相关培养基或细胞库即可自动获得临床申报批准。

同样，某一种MSC研究工艺已经在多个供体或不同规模中获得较好的扩增表现，也不能直接替代面向具体治疗产品的工艺表征、质量分析及可比性研究。

因此，对于MSC开发团队，原料文件和已有研究数据能够减少部分基础信息整理工作，但最终仍然需要根据自身产品、研究阶段及监管要求完成相应验证。

十四、为什么临床研发中的分析可比性不等于临床可比性

在MSC治疗产品开发中，分析可比性研究通常通过体外表型、纯度、分化能力和部分功能检测，判断工艺改变前后的细胞是否具有相近属性。但临床相关效力并不一定能够被所有通用指标充分代表，因此实际产品还需要明确哪些质量属性与预期作用机制和相关生物学功能具有联系。

例如，两种工艺生产的MSC可能都满足某些常规表面标志物要求，但如果其IDO诱导能力或相关分泌特征发生明显变化，就需要进一步判断这些差异是否与目标产品功能有关。

Mesoblast Ryoncil于2024年获得FDA批准，成为MSC治疗产品监管发展的重要案例。但其既往研发及审评历程，应被理解为具体产品自身的监管过程，不能将其中遇到的所有问题归因于单一制造变量，更不能将其他公司的培养工艺验证结果直接套用到Ryoncil。

2026年的Cell & Gene Live讨论强调，在生产技术发生较大改变时，需要及时分析制造过程、细胞功能与预期临床表现之间的关系。这也说明，工艺可比性应在制造策略设计阶段就被考虑，而不是等到后期规模化完成后才开始补充。

十五、总结：PDL是比较起点，CQA才是关键验证内容

RoosterBio相关MSC公开研究提供了一种值得参考的工艺开发思路，即在比较2D和3D培养方式时，将累计PDL、PDT和细胞CQA纳入同一研究框架，并进一步通过多供体和不同反应器规模的实验观察工艺稳健性。

在特定0.1 L微载体培养工艺中，相关研究报告5天获得约2×10⁵–6×10⁵ cells/mL，最终PDL为16–20；在另一组Ambr250与Biostat STR相关放大研究中，50 L两次独立运行的单批产量均超过250亿个MSC。这些数据说明不同培养技术已经能够在相应研究条件下获得实际放大结果，但并不能仅凭产量或PDL确认所有细胞质量属性均保持一致。

对于MSC及MSC-EV开发，真正完整的工艺可比性研究应同时考虑细胞来源、累计扩增水平、培养环境、表面标志物、分化潜能、免疫调节、分泌谱以及与具体产品功能相关的质量指标。只有在这些数据得到充分验证以后，才能对某一次培养模式切换或规模放大的可比性形成有依据的判断。

参考文献

[1] Cell & Gene Live. Scaling Next-Gen MSC Therapies Without Scaling Risk. 网络研讨会，2026年9月10日。主要讨论MSC规模化过程中的制造变更、细胞效力及产品可比性。

[2] Adlerz K, Takacs J, Kirian RD, Trempel M, Rowley JA, Ahsan T. A scalable and xeno-free bioreactor system for biomanufacturing of hUC-MSCs. Cytotherapy. 2020;22(5), Supplement. 会议摘要。

[3] RoosterBio Blog. Advances in Clinical Translation & Scale-up of MSCs & Extracellular Vesicles at ISCT 2019.

[4] Lembong J, Kirian R, Takacs JD, Olsen TR, Lock LT, Rowley JA, Ahsan T. Bioreactor Parameters for Microcarrier-Based Human MSC Expansion under Xeno-Free Conditions in a Vertical-Wheel System. Bioengineering (Basel). 2020;7(3):73. DOI: 10.3390/bioengineering7030073.

[5] RoosterBio Blog. From Elephant Ears to Ambr Waves: A New Path Toward Scale & Abundance for Biomanufactured hMSCs & Their Exosomes.

[6] RoosterBio & Sartorius. Successful development of a scalable and robust process for MSC-EV production.

关于技术来源

本文基于RoosterBio公开MSC生物工艺技术资料、同行评审研究、会议摘要及行业研讨会相关信息，曼博生物整理，用于MSC规模化、2D/3D可比性和MSC-EV工艺开发的科研信息分享。文中PDL、PDT、细胞密度、50 L产量及CQA结果均对应具体研究条件，不应直接外推至所有供体、细胞来源或生产设备。分析可比性、制造放大与产品临床可比性属于需要分别评价的问题，实际工艺应结合目标产品的质量属性和相应验证数据进行判断。