不止静态验证：EMSA解析TF- DNA互作动态调控

转录因子与靶基因启动子的结合是基因表达调控的核心环节，EMSA是平时体外验证转录因子与启动子是否结合最常用的实验之一。

当前EMSA大量研究集中于单纯验证转录因子与启动子是否结合或者验证核心结合位点等静态研究角度，除此之外其实还可通过搭配多组 EMSA 梯度实验，验证转录因子蛋白修饰前后、有无其他蛋白参与时的功能变化。

现有大量研究证实：蛋白磷酸化等翻译后修饰可通过改变转录因子空间构象，显著调控其DNA结合能力；同时，第三方辅助蛋白的相互作用，也可正向促进或负向阻断转录因子与DNA的结合过程，参与精准的转录调控。第三方互作蛋白、翻译后修饰如何动态改变转录因子与DNA的结合能力，为解析上游调控通路提供关键生化证据。

今天我们结合近年高分植物相关文献，通过经典文献案例拆解EMSA实验在动态调控机制研究中的应用。

图1  EMSA原理图

EMSA 经典应用：体外验证转录因子与靶启动子的特异性结合

首先，最常见的是通过EMSA实验验证转录因子和启动子是否互作，以2026发表在Plant Communications上的“The TaDof-2D-miR1832-TaP450-7A module regulates low-temperature-induced seed dormancy release in wheat”为例。

作者首先发现一个微小RNA（miR1832）会增强种子的休眠状态。而后作者通过酵母单杂筛选到转录因子TaDof-2D，经EMSA、Dual-LUC验证了转录因子TaDof-2D能够结合miR1832的启动子并抑制其转录。其中EMSA实验结果显示 GST-TaDof-2D 重组蛋白能够与miR1832启动子探针形成蛋白-DNA 阻滞复合物；梯度冷竞争探针可有效竞争滞后条带，突变探针则丧失结合能力，证明了TaDof-2D可以直接且特异性识别miR1832启动子顺式序列，提供了体外直接结合证据。

体外实验EMSA与体内实验Dual-LUC相互印证来充分说明TaDof-2D能够结合miR1832的启动子，为后续揭示了低温诱导休眠解除、培育具有最佳休眠水平的小麦品种提供了分子基础（图2）。

图2  TaDof-2D抑制miR1832的转录

空间调控探究：利用EMSA揭示互作蛋白通过空间位阻影响TF-DNA结合

基础EMSA能够清晰证实转录因子与靶基因启动子的直接结合，完成二元互作关系验证。然而生物体内转录活动处于动态调控之中，第三方功能蛋白/其他影响因子也常常参与其中进而影响转录因子与DNA的结合能力。通过在EMSA反应体系增设蛋白分组，我们便能直观捕捉结合条带的强弱、迁移位置变化，阐明第三方蛋白/其他影响因子发挥激活或抑制作用的分子效应。

以2025年发表在The Plant Cell上的“EMBRYONIC FLOWER 1 regulates male reproduction by repressing the jasmonate pathway downstream transcription factor MYB26.”为例。

为探索EMF1的抑制机制，作者首先通过酵母双杂交筛选以及Co-IP验证了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中H3K27me3的效应因子EMF1与MYB26互作，并确定了EMF1 756-775片段与MYB26的N端R2R3 DNA结合结构域在二者互作中起重要作用。为验证EMF1 756-775与MYB26 DNA结合域互作是否干扰MYB26结合DNA的能力，作者先通过ChIP、GUS等实验验证了MYB26能结合NST1（NAC次生壁增厚促进因子1）和NST2的启动子。而后经EMSA发现 MYB26 R2R3能结合NST1-b DNA片段，且在EMF1 756-775存在下，二者的结合能力呈浓度依赖性减弱。Dual-LUC也显示出类似的实验结果，表明EMF1通过花药中的双子叶植物保守基序结合转录因子MYB26的DNA结合域来抑制MYB26的活性，从而抑制NST1和NST2的转录（图3）。为完善EMF1调控MYB26转录功能来维持雄蕊发育稳态方面的重要作用以及揭示蛋白与其互作转录因子招募新型抑制机制提供了分子理论基础。

图3  EMF1通过保守基序抑制MYB26活性从而介导雄蕊次生细胞壁

除第三方蛋白外，多个转录因子相互结合形成复合体后再结合靶DNA，也可用EMSA验证，最终可能会出现迁移速率不同于单体的全新阻滞条带。借此可区分：转录因子形成二聚体后增强结合能力，或是抑制结合活性。亦或是在反应体系中直接加入激素、次生代谢物、离子等小分子，观察阻滞条带变化，验证信号分子是否直接作用于转录因子，进而调控其 DNA 结合活性。

修饰调控探究:借助 EMSA 解析磷酸化修饰重塑TF- DNA互

上述案例展示了蛋白间互作如何调控转录因子的DNA结合活性，主要是依靠EMF1与 MYB26 DNA结合结构域发生互作，空间位阻阻碍MYB26结合靶 DNA（竞争 / 遮蔽 MYB26 的DNA结合域），从而削弱MYB26结合DNA的能力。除这一调控模式外，转录因子自身的蛋白状态同样决定其 DNA 结合能力，其中翻译后修饰是最为普遍的调控方式。可以通过 EMSA 解析转录因子发生磷酸化等修饰后，结合顺式元件能力的动态变化。

以2026年发表在The Plant Cell上的“The EDR1-PP2A phospho-regulatory module fine-tunes MYC2-mediated plant disease resistance.”为例。

作者首先用IP-MS筛选以及酵母双杂交、BiFC、Co-IP等实验验证了与Raf 样激酶EDR1互作的蛋白MYC2，体内外磷酸化实验结果表明EDR1能够磷酸化MYC2并确定了磷酸化位点为T353/T357。为验证磷酸化对MYC2功能的影响，作者进行了EMSA实验，发现MYC2 能与RD22启动子结合，与MYC2相比，MYC2TT-AA和MYC2TT-DD对RD22启动子的结合明显增加和减少；ChIP-qPCR也显示同样的结果，表明EDR1会磷酸化MYC2，从而降低其与RD22启动子的结合能力（图4）。EMSA证实EDR1介导的磷酸化修饰直接削弱MYC2的DNA结合活性，将EDR1引发的MYC2翻译后修饰与转录因子的DNA结合功能建立直接因果联系，为体内ChIP实验提供体外分子机理支撑，也为阐明EDR1-PP2A模块通过可逆磷酸化精细调控MYC2转录功能奠定了分子基础。

图4  MYC2被EDR1磷酸化并受到抑制

除磷酸化外，乙酰化、SUMO化、甲基化、氧化修饰（过硫化 / 亚磺酰化）均可利用 EMSA 开展验证。对比修饰型蛋白与未修饰蛋白、位点突变蛋白的结合能力，明确修饰事件是否直接改变转录因子与顺式元件的相互作用。

不难看出，EMSA 能够实现的验证形式十分丰富。它早已不再局限于简单判断转录因子与启动子是否存在静态结合，借助反应体系的灵活调整，可解析第三方蛋白、各类翻译后修饰对 TF-DNA 互作的动态调控效应，还能用于顺式元件鉴定、转录因子竞争性结合、异源二聚体功能分析、修饰对功能的影响等多种机制探究。作为经典体外生化手段，EMSA持续为转录调控通路挖掘提供关键证，助力我们层层拆解复杂的植物转录调控网络。