ソース
概要
COVID-19を引き起こすSARS-CoV-2ウイルスによる感染を予防するためのワクチンが急速に開発されていることから、体液性保護反応の発現という点で、異なるワクチンの能力を比較する必要がある。本研究では、高感度で信頼性の高いフローサイトメトリー法を用いて、スペインで実施されているワクチンを1回または2回接種した健康なボランティアの血液中のIgG1アイソタイプの抗体価を測定した。この方法の多重化能力を利用して、オリジナルのWuhan株、変種であるB.1.1.7（Alpha）、B.1.617.2（Delta）、B.1.617.1（Kappa）のSタンパク質に対する抗体の反応性を同時に測定した。ChAdOx1 nCov-19/AstraZeneca、mRNA-1273/Moderna、BNT162b2/Pfizer-BioNTech、Ad26.COV.S/Janssenの各ワクチンの初回接種後に産生された抗S抗体の力価には有意な差が見られた。最も重要なことは、2回目のブースト免疫後に、Alpha、Delta、Kappaの各変種に対する血清の反応性が、Wuhanの変種に対して相対的に低下したことである。これらのデータは、抗S抗体の生成という点で異なるワクチンを比較することを可能にし、同じSタンパク質配列で繰り返し免疫することの利便性に疑問を投げかけています
本文
はじめに
（https://covid19.who.int/region/euro/country/es）。スペインでより一般的に投与されているワクチンは、BioNTech/Pfizer社のmRNAワクチンBNT162b2（BNT）、Moderna社のmRNA-1273、Oxford University/AstraZeneca社とJanssen/Johnsson&Johnsson社のアデノウイルスベースのワクチンChaAdOx1 nCov- 19（ChAd）とAd26.COV2.S（Ad26）です。すべてのワクチンは、臨床試験において安全性と防御性が実証されています(ref 1-4)が、ChAdワクチンとAd26ワクチンの両方に関連した血栓性血小板減少症の稀な症例の報告があります(ref 5,6)
しかし、SARS-CoV-2のVOC（variant of concern）、特に非常に高い感染力を持つDelta variant（B.1.617.2）の出現(ref 7)により、欧米ではワクチン戦略が脅かされている。Delta variantに対するワクチンの有効性が低下していること(ref 8)、ワクチン接種完了した人が感染し、他の人にウイルスを効率的に拡散させる可能性があること(ref 9) また、免疫抑制状態の患者に3回目のブーストワクチンを接種し、スパイク（S）タンパク質に対する抗体価を高める可能性も検討されている(ref 10) さらに、ワクチン接種完了した人でもデルタ型が広がっていることから、各国の当局は、一般の人々に3回目のワクチンを接種する可能性を検討しています（https://english.elpais.com/society/2021-07-23/everything-pointing-to-need-for-a-third-covid- 19-vaccine-dose-says-spanish-health-minister.html。ワクチンを接種した人にデルタ型が感染する能力は、ワクチンに反応して作られる抗体による中和を逃れる能力と相関しているようです(ref 7)
血清学的検査は、通常、SまたはNタンパク質の組換え断片を用いて、血清中のウイルス抗原特異的IgGまたはIgMの存在を検出することにより確立され、ELISAまたはラテラルフローアッセイに基づく検査が行われる(ref 11,12) これらの検査法の欠点は、中和抗体がNタンパク質に向けられていないことと、Sタンパク質の組み換え断片が、ウイルスエンベロープのスパイクタンパク質のネイティブフォームであるタンパク質3量体の4次構造を欠いていることである。したがって、組換えタンパク質の発現に基づく血清学的検査では、ネイティブなS三量体に対する中和抗体の一部が見逃される可能性がある。最近，我々は，造血系細胞株Jurkatを用いて，SARS-CoV-2のネイティブSタンパク質と，ヒトEGF受容体の切断型（huEGFRt）を発現させて，フローサイトメトリー（FC）検査を行った (ref 13)この方法では、血沈後の患者の血清中の血清陽性率を正確に判定し、抗体価を測定することができる13。ここでは、このFC法を用いて、スペインで使用されている最も一般的な4種類のワクチンの初回免疫および追加免疫に対するSタンパク質に対する抗体の産生を比較した。さらに、この方法の多重化能力を利用して、VOCの例として、オリジナルのWuhan分離株とAlpha、Delta、Kappa分離株のSタンパク質に対するワクチン接種者の血清の反応性を同時に測定しました。今回の結果は、同じワクチンの3回目の接種の利便性についての議論に一石を投じるものである
結果
4種（ChaAd、Moderna、BNT、Ad26）のワクチンに対するIgG1抗S抗体価の比較
我々は以前、レンチウイルスベクターを用いて、SARS-CoV2のフルスパイク「S」タンパク質をオリジナルのWuhan-1配列で発現させ、続いてT2A自己切断配列で連結された切断型ヒトEGFRタンパク質（huEGFRt）を導入した細胞で発現させた (ref 13) このシステムでは、2つのタンパク質をモノシストロンのmRNAから発現させることができる。我々は、ヒト白血病細胞株Jurkatでコンストラクトを発現させるために、導入上清を製造した。Sタンパク質の発現がhuEGFRtの発現と連動していることを利用して、Sに対する抗体とhuEGFRに対する抗体の平均蛍光強度の比を算出し、異なるドナーの血清などに含まれるSタンパク質に対する免疫グロブリンの相対的な量を直接推定した。このシステムを用いて、2021年1月から8月までスペインで使用された異なるワクチンに対するIgG1産生の観点からの相対的な体液反応を調べた。Ad26.COV2.S（Ad26）ワクチンは、他の3つのワクチン（BNT162b2（BNT）、mRNA-1273（Moderna）、ChaAdOx1 nCov-19（ChAd））のように2回のプライム・ブーストではなく、当初は1回で投与することが計画されていたため、まず、初回投与から3～4週間後にワクチンを接種した健常者で誘発された抗体の力価を比較しました。その結果、ChAd（n=37）は、Moderna（n=54）やBNT（n=75）よりも低いIgG1抗S抗体の力価を誘導することがわかりました（図1A）。しかし、ChAdとAd26（n=11）に反応して誘発された力価には、有意な差はなかった。2020年3月から5月の間にSARC-CoV-2感染から回復した患者のコホート（https://covid19.who.int/region/euro/country/es）に存在する抗体価と比較して（Patients 2020, n=58, Figure 1A）、ChAdの1回の投与によるワクチン接種は、有意に低い抗体価を誘発した（P<0.0001, One- way ANOVA test）。対照的に、BNTまたはModernaのいずれかを1回投与すると、2020人の患者に存在する抗体価よりも高い抗体価が誘発された。残念ながら、Ad26グループのサンプル数は、Patients 2020コホートとの有意な比較を確立するには不十分であった
これらのデータを総合すると、2つのRNAワクチン（BNTおよびModerna）は、2つのアデノウイルスベースのワクチン（Ad26およびChAd）よりも、IgG1抗S抗体を誘導する効率が高いことが示唆される
次に、ChAd、Moderna、BNTの各ワクチンのプライミングおよびブースター用量に応じて生成された抗S IgG1抗体の力価を比較した。ChAdワクチンの2回目の投与(PD2; n=39)により、抗体価は2020年の患者やModernaを2回接種した人(PD2; n=52; 図1B)と同等のレベルまで大幅に上昇した。それにもかかわらず、2回のBNT投与（PD2、n=119）によって誘発された抗体価は、2回のChAd投与に反応して生成された抗体価よりも依然として有意に高かった（図1B）
興味深いことに、ModernaまたはBNTの2回の投与（PD2）に反応して生成されたIgG1の力価は、最初のプライミング投与（PD1、図1B）に反応して生成された力価よりも有意に高くなかった。これらの結果は、IgG1抗S抗体価に関して、ChAdを2回投与することには明確なメリットがあるが、ModernaやBNTを2回投与することにはメリットがないことを示唆している
プライミング-ブースターワクチン接種後に産生されたAlpha (B.1.1.7) VOCのSタンパク質に対するIgG1抗体価フローサイトメトリーJurkat-S法は、1つのタンパク質（REF）または複数のタンパク質に対する異なる抗体の産生を同時に測定するために、容易に多重化することができる。この特性を利用して、Wuhan株のSタンパク質に対する抗体の生成を、Alpha (B.1.1.7) VOCのSタンパク質に結合できる抗体と比較して測定することにしました。今回のワクチンがすべて武漢株の配列に対して作られたものであることから、この比較は関係があるのではないかと考えた。アルファVOCのSタンパク質の配列は、武漢株の配列とわずか7カ所しか異なりませんでした（図EV1）。αVOCは、2021年の春にスペインで優勢になった（https://theconversation.com/the-uk-variant-is-likely- deadlier-more-infectious and-becoming-dominant-but-the-vaccines-still-work-well-against-it- 156951）
そこで、今回の実験と前回の実験に、2021年3月から5月にかけてSARS-CoV-2に感染して回復した患者の血清コホートを加えた（Patients 2021, n=20, 図1および2）
αVOCのSタンパク質に対する抗体の存在を検出するために、オリジナルのJurkat-S細胞（REF）の作製に使用したのと同じレンチウイルスベクターに、変種のS配列（図EV1）をクローニングしたが、huEGFRtレポーターをEGFPに置き換え、α変種のSタンパク質とEGFPを安定的に発現するJurkat細胞を作製した。この新しいJurkat-S細胞（以降、Jurkat-S[Alpha]と呼ぶ）を用いて、プライム・ブースト・ワクチン接種後にAlpha VOCのSタンパク質に対して生成されるIgG1抗体の力価を測定することができた。その結果、Wuhan株の場合と同様の結果が得られました（図2Aと図1Bを比較）。すなわち、ChAdの2回目の投与では1回目の投与に比べて抗体価が有意に上昇し、ModernaとBNTの2回目の投与では、プライミングの1回目の投与に比べてIgG1抗S抗体価の有意な上昇は見られませんでした（それぞれP=0.43とP=0.92、一元配置分散分析法による検定結果）
Jurkat-S(Wuhan)細胞とJurkat-S(Alpha)細胞に使用されている異なるマーカー（それぞれEGFRとEGFP）を利用して、両細胞株を同数混合し、この混合細胞をSARS-CoV-2感染から回復した患者またはワクチン接種を受けた患者の血清の希釈液とインキュベートすることができた。フローサイトメトリーによる解析では、GFP+細胞にゲートを設定し、アルファバリアントのSタンパク質に対するIgG1アイソタイプの抗体の力価を測定するために、[抗S蛍光/GFP蛍光]の比を算出することができた（図2B）
同時に、EGFR+細胞にゲートを当てて、[蛍光抗S/蛍光抗EGFR]の比率を武漢株のSタンパク質に対するIgG1アイソタイプの抗体の力価の測定値として算出することができた。同じ実験でJurkat-S(Wuhan)細胞とJurkat-S(Alpha)細胞を組み合わせることで、WuhanとAlphaのVOCのSタンパク質に対する相対的な反応性の観点から、ワクチン接種を受けたボランティアの血清を比較するのに役立つ比率（S/GFP vs S/EGFR）を算出することができる
興味深いことに、Modernaの2回目の投与とBNTの2回目の投与により、Wuhan-1分離株と比較して、AlphaのVOCに対する抗体の反応性が相対的に低下した（図2C）
ChAdの2回目の投与は、Wuhanと比較して、AlphaのSタンパク質の相対的な認識の増加または減少のいずれも引き起こさなかった
2020年と2021年に感染から回復した人の血清とワクチンから得られた血清の相対的な反応性を比較したところ、3種類のワクチンのいずれかの2回目の投与に反応して作られた抗体は、2021年だけでなく2020年にも自然感染によって作られた抗体よりもAlpha株との反応性が相対的に低いことが示された（図2C）
これらの結果は、武漢株の配列に基づいた3種類のワクチンの2回目の投与によるブースター免疫が、SARS-CoV-2の出現したVOCとの抗体の反応性を低くする可能性を示唆している
ブースターワクチン接種後のVOCに対する相対反応性の全般的な低下
2回目のワクチン接種後に検出された抗-S（α）相対反応性の低下が、より新しいSARS-CoV-2のVOCに対しても同様に当てはまるかどうかを調べるため、Jurkat- Sシステムを改良し、4つの変異株に対するIgG1の結合を測定した。Wuhan、Alpha、Delta（B.1.617.2）、Kappa（B.1.617.1）の4種類の変異株に対するIgG1結合を測定するように変更した
DeltaおよびKappaバリアントのSタンパク質を発現するJurkatをWuhanおよびAlphaのものと区別できるようにするために、EGFRおよびEGFPマーカーを持つ同じレンチウイルスベクターを用いて、TCRのCD3ζサブユニットをCRISPR/Cas9で欠失させて当研究室で作製したJurkat CD3陰性細胞株を導入した
これらのCD3陰性のJurkat細胞に、Delta VOCのSタンパク質とEGFRを共発現させたレンチウイルスベクター、またはKappa VOCのSタンパク質とEGFPを共発現させたレンチウイルスベクターを導入した。この戦略により、4つのJurkat-S細胞株を混合して血清サンプルと同時にインキュベートし、その後、CD3、EGFR、GFPマーカーを用いて4つのVOCに対するIgG1の結合を測定することができた（図3） 図3は，陽性対照血清と陰性対照血清が4つのVOCを染色する様子を示したものである。4つのVOCのいずれかに結合するIgG1を含む陽性血清は斜線を描き、陰性血清は平線を描く（REF）
2020年と2021年に感染後回復し、その後BNTを接種した老人ホームのボランティアの血清を用いて、アルファ、デルタ、カッパのVOCのSタンパク質と武漢株のSタンパク質の相対的な認識に対するワクチン接種の効果を追跡した（表1）。血清サンプルは、ワクチン接種の直前（pre-Vacc、n=46、図4）、BNTワクチンの1回目の投与から15～21日後（PD1、n=49）、2回目の投与から4週間後（PD2、n=70）に採取した
BNTの1回目の投与により、AlphaおよびKappaのVOCに対する抗体反応性が有意に上昇したが、WuhanおよびDeltaのVOCに対する抗体反応性は上昇しなかった（図4A）ワクチン接種前と比較して、2回目のBNT投与（PD2）では4種類のVOCに対する抗体価が有意に上昇したが、DeltaとKappaについてはPD1とPD2で誘発された抗体価の違いは明らかではなかった（図4A）実際、アルファ、デルタおよびカッパのVOCに対するIgG1抗体の相対的な反応性は、武漢株のそれと比較して、BNTの2回目の投与後に1回目の投与後と比較して有意に低下した（PD1対PD2、図4B）保育園のワクチン接種を受けたドナーのサンプルを用いたこれらの結果は、ブースターワクチンの接種により、アルファ、デルタ、カッパのVOCの認識が相対的に失われることを示唆する図2Cのデータを裏付けるものである
考察
この研究では、スペインで最も頻繁に使用されている4種類のワクチンに対する、SARS-CoV-2のスパイクタンパクに対するIgG1アイソタイプの抗体の産生を測定した。これらのデータを、2020年3月～6月に発生したCOVID-19パンデミックの第1波で感染して回復した患者の血清に含まれる抗体、および2021年3月～5月に発生した第4波で感染して回復した患者の血清に含まれる抗体と比較しました。その結果、mRNAワクチンであるBNT/PfizerおよびModernaの初回投与は、アデノウイルスベースの2種類のワクチンChAdおよびAd26よりも、Wuhan株のSタンパク質に対する高い抗体反応を有意に誘導し、2020年および2021年の患者コホートで見られた抗体価よりも優れていた。2回目の投与によるブースター免疫では、ChAdワクチンを除き、抗体の平均力価は上昇しなかった
ChAdによるブースター免疫では、Modernaによるブースター免疫や2020年と2021年の患者コホートで得られた抗体価と同程度の抗体価が得られましたが、BNTによるブースター免疫で得られた抗体価よりはまだ低いものでした。つまり、今回の結果をまとめると、ChAd、BNT、Modernaの3種類のワクチンを2回接種することで、オリジナルのWuhan株に対する抗体価を、死後の患者に見られる抗体価と同等、あるいはそれ以上に誘導できることがわかります。しかし、Alpha、Delta、Kappa亜種とWuhan株に対する抗体の相対的な反応性を比較した場合、メッセージは異なります。オリジナルのWuhan株の配列に基づくワクチンに反応して作られた抗体は、他の3つの変種とも結合することから、ほとんどのエピトープがワクチンと変種の配列の間で保存されていることが示唆されますが、ブースター用量のワクチンを投与すると、3つのVOCに対する反応性がWuhan株に比べて相対的に低下します。これは、同じ抗原配列を繰り返し免疫することで、免疫原のエピトープにより適合する親和性の高い抗体が生成されることから、ある程度予想されることである
この親和性の向上は、抗体の「幅」、すなわち免疫原のものとはわずかに異なるエピトープに結合する能力を低下させるという負の副作用をもたらす。高親和性の抗体を作製しても系統特異的になってしまうという現象は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に対する広範な中和抗体の研究で広く知られている(ref 14)膨大な数のクローンや変異体が存在するHIVの感染を防ぐワクチンの開発には、長期にわたって苦心してきましたが、いまだに成功していません。テストされたワクチンは、免疫に使用された株による感染を防ぐのには有効ですが、現場で発見された無数の変異体による感染は防げないというのが一般的な結論です(ref 15)別の例として、予防接種キャンペーンで分離された不活化インフルエンザウイルスをワクチン接種した結果、特定の季節性インフルエンザウイルスは効率的に中和されるが、他のウイルスを中和する能力は低下することが分かっている(ref 16) 対照的に、自然感染に対する抗体反応は幅広く、異なる免疫優位性パターンを示します (ref 16)
COVID-19に関しては、Sタンパク質やその他のウイルスタンパク質に対する広範かつ持続的な多抗原性免疫反応がCOVID-19患者にも認められており、この場合、症状の重さと関連しています (ref 17) BNTを2回接種した老人ホーム入居者のコホートを追跡調査した結果、2回のワクチン接種により、4つの亜種すべてに対する抗S抗体の力価が上昇したことがわかった。しかし、1回目のワクチン接種の効果と比較して、2回目のワクチン接種ではDeltaおよびKappa亜種に対する抗体価のさらなる上昇は見られず、3つのVOCすべてに対する抗体の相対的な反応性を低下させるというマイナスの効果が見られた。これは、2021年に欧州と米国で最も急速に拡大したVOCが、最初にAlphaバリアント、後にDeltaバリアントであったことに関連しています（https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/fully-vaccinated- people.html） 興味深いことに、Jurkat-S FCアッセイに似た、ヒトB細胞株Ramosを用いたアッセイを用いた最近の研究でも、BNTによるブースターワクチン接種により、Wuhan株に対する抗S抗体の力価が上昇するが、AlphaおよびBeta変種に対する抗体は上昇しないことが示されている(ref 18)
我々の研究は、SARS-CoV-2のSタンパク質に対するIgG1の存在を測定することに限定されているが、IgG1はヒトの血液中に最も多く存在する免疫グロブリンであり、補体を固定したりFc受容体に結合したりすることで強力なエフェクター能力を持っていることを考えると、我々の結果は体液性反応全体を評価するのに適していると考えられる19。現行のVOCとの相対的な反応性の低下を示す我々の結果は、武漢配列に基づく現行のワクチンを一般の人々に3回目に投与することが、新たなVOCに対する免疫力を高めるための最良のアプローチではないことを示唆している。私たちの意見では、3回目の接種は、最初の2回のプライムドーズとブーストドーズに対する反応が悪かったことが証明された集団に限定すべきであり、一般集団には適用しない
材料と方法
細胞
ヒトT細胞株JurkatクローンE6-1は、ATCC（TIB-152）から入手し、5％ウシ胎児血清（FBS、Sigma）を添加したRPMI1640で5％CO2インキュベーター内に維持した。ヒト胚性腎臓HEK293T細胞（ATCC CRL-3216）は、5％CO2インキュベーターで10％FBSを補充したDMEMで維持した。すべての細胞株は、マイコプラズマが存在しないことを定期的に確認した
レンチウイルスベクターとJurkat細胞の導入
Wuhan変異体のスパイクタンパク質を発現するJurkat-S細胞の作製については、既に説明した通りである(ref 13) Jurkat細胞株でAlpha (B.1.1.7)、Delta (B.1.617.2)、Kappa (B.1.617.1) SARS-CoV-2変異体の全長スパイクSタンパク質を発現させるために、epHIV-7プラスミドをベースにしたレンチウイルスベクターを使用し、スパイクSタンパク質の配列はPublic Health Englandデータベース(https://www.gov.uk/coronavirus)から入手し、Eurofins Genomics社で合成した。WuhanおよびAlpha（B.1.1.7）の変異体はJurkat CD3+細胞で発現し、Delta（B.1.617.2）およびKappa（B.1.617.1）の変異体はJurkat CD3-細胞で発現した。Jurkat CD3-細胞は、当研究室でCRISPR/Cas9システムを用いて作製しました。EGFPの配列は、ベクターpEGFP-C1 (Addgene)から得た。プラスミドの構築はGibson Assembly®法で行った
トランスダクションのために、トランスフェクトされたパッケージングされたHEK-293T細胞から、以前に記載されたように、レンチウイルスを導入する上清を製造した20。レンチウイルスは，プラスミドpCMV-dR（gag/pol）とpMD2.G（VSVエンベロープタンパク質）をJetPEIトランスフェクション試薬（Polyplus Transfection）を用いて共トランスフェクションすることで得た。トランスフェクションの24時間後および48時間後にウイルス上清を得た。Jurkat細胞へのトランスフェクションに先立ち，ウイルス上清にポリブレン（8μg/mL）を添加した
合計5x100000個のJurkat細胞を350μLのRPMIでP24平底ウェルにプレーティングし、350μLのウイルス上清を加えた。細胞を2200rpm、32oCで90分間遠心分離し、24時間培養した。導入したGFP+またはHuEGFRt+細胞を48時間後にFACSソーティングで選択し、培養で拡大した
ヒト血清
合計700人のヒト血清を検査した。最初のセットは，COVID-19パンデミックの第一波が発生した後の2020年に得られたEmpireoの50個の血清であった．血清提供者は、以下のパラメータによる臨床分類を可能にするためのアンケートに回答した。無症状（Asymptomatic）：症状がない、軽度（Mild）：非生産的な咳、発熱、頭痛、咽頭痛、呼吸困難、無力感、筋肉痛、老衰、異臭、皮膚病変のうち3つ以上の症状がある、中等度（Moderate）：上記の症状のうち3つ以上に加えて消化器症状がある、または上記の症状のうち3つ以上が7日以上続いている、中等度-重度（Moderate-Severe）：上記の症状のうち3つ以上に加えて肺炎がある、重度（Severe）：入院と挿管が必要な肺炎がある。もう1セットの52個の血清サンプルは、「Immune response dynamics as predictor of COViD.19 disease evolution」という研究から選ばれました。研究倫理委員会で承認されたHospital Universitario La Princesa（HUP）の研究「Immune response dynamics as predictor of COViD.19 disease evolution. Implications for therapeutic decision-making」から52個の血清サンプルを選びました（No.4070）。第3のセットは、保育園とVITROの従業員から得た250の血清です。4つ目のセットは、マドリッドの中学校の教師と従業員から40個の血清サンプルを入手しました（匿名性を保つため名前は伏せてあります）。最後に、2021年1月～7月の期間にCBMSOで働くボランティアの毛細血管から250の血清サンプルを入手した第5のコホートは、研究倫理委員会（No.2352）で承認された研究「COVID-19におけるSARS-CoV-2感染の高リスク集団の特定と進化の予後に有用なバイオマーカーとしてのACE2」に含まれています。参加者全員が、EUガイドラインおよびヘルシンキ宣言の倫理原則に従って実施された本研究への参加に書面で同意した
フローサイトメトリー
Alpha型とWuhan型に対する抗体の相対的な結合を調べるために、Jurkat-S(wuhan)細胞とJurkat-S(Alpha)細胞を1:1で混合し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.02%アジ化ナトリウムで1:50に希釈したヒト血清と氷上で30分間インキュベートしました。細胞を900gで5分間回転させ、ペレットをPBS-BSA緩衝液に再懸濁し、回転させて過剰な抗体を除去した。さらに2回の洗浄を行った。最終的に細胞ペレットを、PBS-BSA中のマウス抗ヒトIgG1 Fc-PE（Ref.：9054-09、Southern Biotech社）の1：200希釈液と、Brilliant Violet 421TM抗ヒトEGFR抗体（Ref.：352911、Biolegend社）の1：200希釈液に再懸濁した。その後、サンプルを洗浄し、生存率色素7AADで標識し、FACSCanto IIフローサイトメーター（Becton-Dickinson社製）で分析し、データはFlowJoソフトウェア（BD社製）で解析した。4つのバリアントを同時に研究するために、Jurkat-S(wuhan)、Jurkat-S(Alpha)、Jurkat-S(Delta)およびJurkat-S(Kappa)細胞の1:1:1:1ミックスを前述のようにインキュベートしたが、CD3+細胞とCD3-細胞を識別するために、APC抗ヒトCD3抗体（BD Ref.：317317）を1:200の希釈で加えた
統計情報
異なるグループのカラム解析には、一元配置のANOVA検定を使用した。すべてのデータはGraphPad Prism 7ソフトウェアを用いて分析した
血清サンプルは提供者からコード化されて受け取り、すべてのデータ分析が確定するまで、実験者はその性質を盲検した。サンプル分析は二重または三重に行い、すべての実験は最低2回繰り返した
