【署名文献分享】低温产生大量 ROS 如何化解？菊花 DgbHLH2-DgGST 通路给出答案

标题：DgbHLH2通过激活DgGST的表达来调节菊花中的ROS清除，从而正向调节耐寒性

DgbHLH2 positively regulates cold tolerance by activating DgGST expression to mediate ROS scavenging in chrysanthemum

发表单位：四川农业大学刘庆林等教授团队

发表期刊：Industrial Crops & Products

影响因子：6.2

发表时间：2026年4月8日

研究背景：

菊花对低温较敏感，导致生长发育以及观赏性受影响，因此提高菊花的耐寒性对于菊花产业至关重要。植物在感知冷胁迫时会激活下游的信号通路，激素信号传导在该胁迫下也起着重要作用，随着信号的传递，关键转录因子会被激活，比如 MYB 和 bHLH 参与调控，形成复杂的转录网络，进一步诱导寒冷响应基因的激活。冷应激还会导致过量活性氧（ROS）的积累，如 H₂O₂ 和 O₂⁻，这会增强脂质过氧化并升高丙二醛(MDA)水平，从而加剧膜损伤。为抵御这种氧化应激，植物的抗氧化防御系统会被激活，包括增强过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)等酶的活性，这些酶能有效清除活性氧、缓解氧化损伤，同时通过维持细胞完整性来保持相对电解质渗透率(REC)的稳定。通过这些信号转导、基因调控和生理修复过程，植物最终能够适应低温环境。

bHLH转录因子在植物冷胁迫响应中起核心作用，PpbHLH230介导的PpPOD和PpAPX基因的转录激活提升了抗氧化相关酶的表达和活性，并抑制了ROS的积累，然而bHLH及其下游相互作用基因在菊花中的抗寒机制仍不清楚。本篇文章发现了一个由寒冷诱导的bHLH转录因子DgbHLH2，并证明了它在调节抗寒性方面的积极作用。

图：DgbHLH2在菊花冷胁迫中的调控模型

研究结果：

结论1——DgbHLH2 位于细胞核中，有转录激活活性，并且对低温胁迫有反应。

作者前期根据菊花低温转录组数据锁定bHLH 家族，其中DgbHLH2是所有 bHLH 里上调幅度极高的候选基因。亚细胞定位结果（图1a）显示其定位于细胞核上，进一步证明DgbHLH2是转录因子，酵母转录激活实验（图1b）发现DgbHLH2的N端、C端无转录激活能力，中段 134–201 aa（bHLH 结构域）具备转录激活活性，可激活下游靶基因，具备调控下游耐寒基因的分子基础。DgbHLH2 自身启动子含低温响应元件 LTRE，双荧光素酶报告基因与定量分析实验（图1c、f）结果显示4℃低温处理ProDgbHLH2-LUC 荧光活性显著上调，证明DgbHLH2 启动子对低温有响应。qPCR结果（图1d、e）显示DgbHLH2 表达量＞茎＞根，即DgbHLH2 主要在叶片发挥功能（叶片是低温 ROS 损伤主要部位），且4℃处理后，DgbHLH2 表达持续上升，12 h 达到峰值，表明低温显著诱导 DgbHLH2 表达，存在时间依赖性。

图1：(a) 亚细胞定位。 (b) 酵母转录激活实验；右侧面板显示用于测试的DgbHLH2片段。(c) 双荧光素酶实验，将pGreenII 0800-LUC-ProDgbHLH2载体导入烟草(Nicotiana benthamiana)叶片，结果比较对照组(25℃/22℃ 日/夜)与低温处理组(4℃ 4小时)。(d) 组织特异性表达检测：定量分析野生型(WT)菊花根、茎和叶中DgbHLH2基因的相对表达水平。数据采用单因素ANOVA和Tukey检验分析(均值 ± SD，n = 3)。不同字母表示在p ≤ 0.05具有显著差异。(e) 低温处理表达检测：定量分析WT菊花叶片在4℃低温处理0、3、6、12和24小时的DgbHLH2基因相对表达水平，对照组为常温生长(25℃/22℃ 日/夜，CK)。数据采用单因素ANOVA和Tukey检验分析(均值 ± SD，n = 3)。不同字母表示在p ≤ 0.05具有显著差异。(f) LUC活性定量分析：使用t检验(P < 0.05)。数据以均值 ± SD表示(n = 3)。

结论2——DgbHLH2 在低温应激下增强 ROS 清除并维持膜完整性

紧接着作者为研究DgbHLH2在菊花中调控ROS含量的功能，构建转基因菊花材料——过表达与干扰株系，通过NBT和DAB染色（图2d、e）评估ROS（H₂O₂和O₂⁻）的积累情况，OE染色最深，Ri株系染色较浅，且定量分析结果与染色情况一致（图2-f、g），为了弄清DgbHLH2在低温下减少ROS的机制，作者测定了SOD、CAT、GST和POD的活性，结果显示SOD和CAT活性在WT和转基因系之间没有显著差异（图2i、j），而POD和GST活性差异明显，OE系最高，Ri系最低，相比WT（图2h、k）。对于低温下的质膜完整性，MDA含量和电解质渗透率（REC）在OE系最低，其次是WT，Ri系最高（图2l、m）。以上这些结果表明过表达 DgbHLH2 增强菊花耐寒，沉默则耐寒下降，该基因通过提升 GST、POD 活性清除 ROS，减少细胞膜氧化损伤。

图2：(a) 在白天温度25℃和夜间温度22℃条件下，WT、OE和RNAi株系中DgbHLH2的表达水平。 (b) 不同转基因株系和WT株系的存活率：先在6℃培养箱处理，然后在25℃低温下恢复生长6小时，共15天，重复3次，每次重复27株植物。 (c) 菊花在低温胁迫下的表型变化。 (d-m) 在4℃处理下，不同时间点WT和转基因株系生理指标的测定，(d) NBT染色；(e) DAB染色；(f) O2含量；(g) H2O2含量；(h) POD活性；(i) SOD活性；(j) CAT活性；(k) GST活性；(l) 相对电导率（REC）；(m) MDA含量。（差异显著 p < 0.05）。数据采用单因素方差分析和Tukey检验分析（平均值 ± SD，n = 3）。不同字母表示在p ≤ 0.05水平上存在显著差异。

结论3——转录组数据证明 DgbHLH2 广泛调控低温、抗氧化、MAPK 通路关键基因，DgGST 是核心差异靶基因

·  作者将 OE-6、7（OE）、Ri-1、8、9（Ri）和野生型植物（WT）置于 4℃ 下处理 6 小时，随后进行了 RNA-seq 分析。RNA-seq 分析显示，OE vs WT 有 213 个上调基因，Ri vs WT 有 2804 个下调基因，OE 和 Ri 组之间有 1922 个差异表达基因（DEGs）（图 3a、c、d）。根据韦恩图分析，有 21 个基因在三组比较中共同调控：OE vs Ri、Ri vs WT 和 OE vs WT（图 3b）。GO/KEGG 富集结果显示差异基因富集氧化还原酶活性、MAPK 植物信号通路、苯丙烷生物合成、脂肪酸代谢、ABA 响应通路，DgbHLH2 参与多条低温胁迫调控通路。 图 g-i的 qPCR 验证表明DgGST、DgPOD、DgCBF 等耐寒基因在 OE 上调、RNAi 下调，与转录组 FPKM 趋势完全吻合；其中 DgGST 变化幅度最显著，DgGST 是 DgbHLH2 下游关键靶基因。

图3：转基因和野生型（WT）株系的RNA-Seq分析。(a、c 和 d) OE 与 Ri (a)、OE 与 WT (c)、以及 Ri 与 WT (d) 的基因表达变化火山图。(b) Venn 图。OE 与 Ri (绿色)、Ri 与 WT (蓝色)、OE 与 WT (红色) 组间存在差异的基因。(e) 参与冷胁迫的43个关键差异基因的聚类热图。(f) 转基因与 WT 株系的差异表达基因(DEGs)聚类热图。(g-i) DgGST (Cse_sc032588.1_g020.1) (g)、DgPOD (Cse_sc000910.1_g010.1) (h)、DgCBF (Cse_sc001867.1_g010.1) (i) 在 0、3、6、12 和 24 小时在 4℃ 下的基因组浏览器轨迹和 qRT-PCR 分析。采用方差分析（ANOVA）和 Tukey 测试（均值 ± SD, n = 3）。不同字母表示 p ≤ 0.05 时有显著差异。

结论4——酵母TF Centered Y1H、Dual-LUC 、EMSA、ChIP-qPCR 证明 DgbHLH2 蛋白特异性结合 DgGST 启动子 TGAC 顺式元件。

酵母TF Centered Y1H 实验结果显示DgbHLH2 可结合 6 种顺式元件，其中 WRKY71OS（TGAC）为已有胁迫研究报道的功能元件，结合基因组与转录组筛选出靶基因 DgGST（图4、表1）。先前研究表明该基序存在于涉及各种防御反应和生长调控过程的基因启动子中，因此，作者最终选择了 WRKY71OS（TGAC）基序。对菊花基因组的扫描预测了可能含有该基序并能够结合 DgbHLH2 的潜在启动子，该基序出现在 52 个转录因子、98 个激酶和 105 个抗性基因中（表 1）。将这些候选基因与转录组数据整合后，选取了关键基因用于热图构建（图 4c）。Dual-LUC 、EMSA、ChIP-qPCR 实验均证明 DgbHLH2 蛋白特异性结合 DgGST 启动子 TGAC 顺式元件这一结论（图5、6）。

图4：(a) 背景筛查。(b) Y1H 实验，使用 SD/-TL、SD/-TLH 和 SD/-TLH 40mM 3-AT 平板。pGAD53m pHIS-p53（阳性对照）和 pGADT7-bHLH2 pHIS-p53（阴性对照）。(c) 热图，从菊花基因组中筛选出启动子中含有 WRKY71OS（TGAC）基序的基因，并结合转录组数据进行了联合分析。

表1：DgbHLH2 的靶基因识别

图5：(a) pBin2  pGreenII 0800-ProDgGST-LUC，pBin2-DgbHLH2  pGreenII 0800-ProDgGST-LUC，pBin2  pGreenII 0800-LUC，pBin2-DgbHLH2  pGreenII 0800-LUC。(b) 不同共表达组合的相对LUC/RLuc活性。(c) 使用突变的DgGST启动子（TGAC变为TTAC）的双荧光素酶测定：pBin2  pGreenII 0800-ProDgGST(突变型)-LUC，pBin2-DgbHLH2  pGreenII 0800-ProDgGST(突变型)-LUC，pBin2  pGreenII 0800-LUC，pBin2-DgbHLH2  pGreenII 0800-LUC。(d) 不同共表达组合的相对LUC/RLuc活性。

图6：(a) EMSA，DgbHLH2指目标蛋白；ProDgGST（Bio）代表生物素标记的DgGST启动子探针；ProDgGST（未标记）代表未标记的DgGST启动子探针；ProDgGST（Bio-突变体）代表生物素标记的突变DgGST启动子探针。 (b) ChIP–PCR实验，DgGST启动子中的WRKY71OS（TGAC）基序；P1–P3，不同的启动子片段，其中P2包含TGAC元件。

总结：

低温胁迫诱导 DgbHLH2 表达，DgbHLH2 进入细胞核，直接结合 DgGST 启动子 TGAC 元件并激活 DgGST 转录，DgGST 编码 GST 抗氧化酶，提升细胞 ROS 清除能力，降低氧化损伤，最终增强菊花耐寒性。

本篇文章中的“酵母TF Centered Y1H”实验由南京瑞源生物提供。该技术是一种研究DNA与蛋白质之间相互作用的技术，通过已知的转录因子（蛋白），筛选与其存在相互作用的motif，并确定该转录因子可能调控的靶基因，或鉴定蛋白/DNA 上影响结合的关键位点。